Ингибирование PLK1 - ключ к уничтожению резервуаров ВИЧ

Хотя комбинированная антиретровирусная терапия (cART) и эффективна в борьбе с ВИЧ-инфекцией, латентные провирусы ВИЧ все еще остаются серьезным препятствием на пути к искоренению заболевания. 

Как показали исследования, реактивация ВИЧ-1 при использовании агентов, изменяющих латентность вируса, недостаточна для уничтожения резервуара, подтверждая тем самым существование определенных внутренних механизмов выживания. 

Группе специалистов из США удалось установить, что Polo-подобная киназа 1 (PLK1) играет критически важную роль в выживании CD4+ T-клеток, используемых ВИЧ-1 в качестве «резервуара». 

На это указывали повышенные уровни PLK1 во всех ситуациях, когда анализировались латентно инфицированные клетки. По словам ученых, ВИЧ-1 усиливает работу белка PLK1, вызывая его ядерную транслокацию и стабилизацию. Ингибирование PLK1 заметно облегчает возможность реализации стратегии «shock and kill» и искоренения ВИЧ-1-инфицированной CD4+Т-клетки. Кроме того, уверены специалисты, ингибиторы PLK1 значительно сокращают размер резервуаров ВИЧ-1 в первично пораженных CD4+ T-клетках. 

«Результаты наших исследований подтверждают, что ВИЧ-1 использует PLK1 для предотвращения гибели [пораженных] клеток, а сам PLK1 является многообещающей мишенью для химического «уничтожения» клеток-резервуаров ВИЧ-1».

Исследование

Применение комбинированной антиретровирусной терапии (КАРТ) значительно увеличивает продолжительность жизни людей с ВИЧ. Тем не менее, существование латентных штаммов вируса, в основном присутствующих в покоящихся CD4 +  Т-клетках, обеспечивает жизнеспособность вируса, независимо от иммунного ответа хозяина и / или противовирусного эффекта от cART.

«Shock and kill» - активно изучаемая сегодня стратегия, которая, опираясь на использование агентов, изменяющих латентность (LRA) ВИЧ-1, в сочетании cART, способна искоренить вирусные резервуары без глобальной активации Т-клеток. Однако большинство используемых в настоящее время LRA, включая вориностат, ингибирующий гистондеацетилазу (HDAC) (также называемую SAHA), не способны снизить уровень ВИЧ-1.

Такой текущий сбой указывает, что LRA способны «шокировать», но не в состоянии «убить» клетки резервуара. ВИЧ-1 использует клеточную каспаззависимую или независимые механизмы для уничтожения клеток-хозяев в острой фазе, что в основном иллюстрируется активированным CD4 +  Т-клетками. Тем не мение, как лабораторные, так и клинические исследования показывают, что CD4 +  Т-клетки и макрофаги, содержащие скрытые резервуары ВИЧ-1, обладают устойчивостью к CTL-опосредованному уничтожению клеток. Было также показано, что вирусные СРЕ, индуцированные реактивацией ВИЧ-1, недостаточны, чтобы привести к гибели клеток-резервуаров. Одним из возможных объяснений этого является то, что хотя реактивация ВИЧ-1 вызывает вирусные СРЕ, возможно, с ее помощью реактивация ВИЧ-1 одновременно включает определенные механизмы выживания клеток, которые препятствуют гибели пораженных клеток.

Чтобы понять это, вероятно, необходимо больше вимания уделить стратегии «kill», чтобы упростить искоренение клеток резервуара. Одна из идей состоит в том, чтобы активировать ВИЧ-1-специфический иммунный ответ. Однако иммунная активация часто неспецифична и может привести к аутоиммунитету. В последнее время было несколько сообщений о том, что некоторые соединения способны усиливать гибель ВИЧ-1-реактивированных клеток или сократить вирусные резервуары. Хотя эти данные обнадеживают, подобные соединения до настоящего времени подвергались лишь ограниченным исследованиям. Например, неизвестно, могут ли эти соединения также способствовать гибели клеток-хозяев в фазе низкого уровня репликации ВИЧ-1.

Специалисты решили оценить общие механизмы выживания клеток, связанные с реактивацией латентных ВИЧ-1 и выведением штаммов из состояния латентности – процессами, которые могут быть полезны при ликвидации вирусных резервуаров.

Выживание или гибель клеток долгое время считались физиологическим результатом контроля клеточного цикла, в котором Polo-подобная киназа 1 (PLK1) играет жизненно важную роль, особенно для контрольной точки перехода G2-M.

Среди пяти известных PLK, PLK1 является основным из-за его участия в регулировании практически всех фаз клеточного цикла, а также репликации ДНК, реакции на повреждение ДНК, мейоза и других функций. Помимо регуляции клеточного цикла, PLK1 также участвует в передаче сигналов выживания клеток посредством контроля антиапоптотического механизма. Было показано, что некоторые важные белки участвуют в выживании клеток, включая антиапоптотический сурвивин, Stat3, MCL-1 и Bcl-2 (17–19) или проапоптотический Bax, p53 и p73 (20–22), положительно или отрицательно регулируются PLK1, соответственно. PLK1-опосредованная передача сигналов выживания клеток также может быть подвергнута восходящему течению регуляция PLK2 в сценарии митохондриальной дисфункции.

Следовательно, в неделящихся клетках PLK1 способен функционально способствовать выживанию клеток благодаря своей активности, отличающейся от регулирования клеточного цикла. Большинство из вышеуказанных исследований PLK1 были сосредоточены на анализе роли PLK1 при развитии рака. Было отмечено, что экспрессия PLK1 повышена при различных онкологических заболеваниях и ненормально повышена при агрессивности опухолей и плохом клиническом прогнозе. Как in vitro, так и in vivo исследования показали, что истощение PLK1 снижает выживаемость клеток, а также вызывает рост опухоли без воздействия на нормальные клетки.

В рамках исследования специалисты продемонстрировали, что PLK1 играет критически важную роль в поддержании статуса выживаемости клеток ВИЧ-1-инфицированных CD4 + Т-клеток, роль, которая ранее не рассматривалась исследователями.

Кроме того, ученые также оценили потенциал ингибиторов киназы PLK1 для подстратегии «kill» ВИЧ-1-инфицированных CD4 + Т-клеток и сокращения вирусных резервуаров ВИЧ-1 ex vivo.

Результаты

Реактивация латентных ВИЧ-1 приводит к повышению уровня белка PLK1. По словам ученых, уровень белка PLK1 особенно высок в клетках CA5. Это показали  данные иммуноблоттинга и внутриклеточного иммуноокрашивания.

Для оценки эффекта реактивации латентного ВИЧ в клетках CA5 были использованы LRA: агонисты C (PKC) (ингенол, простратин и бриостатин), ингибиторы HDAC (SAHA) и ингибиторы BET (JQ1). Агонисты PKC слегка повышали уровень белка PLK1 в клетках CA5, действие ингенола зависело от дозы и коррелировало с индуцированной ингенолином реактивацией ВИЧ-1. Ингибитор BET (BETi) JQ1 умеренно увеличивал уровень белка PLK1 в клетках CA5. Ингибитор HDAC SAHA не имел влияния на уровень белка PLK1, вероятно, из-за его слабой реверсии латентности в клетках CA5.

Дальнейший анализ мРНК PLK1 уровень указал, что использование LRA вызывает снижение PLK1 транскрипцию до одинакового уровня в клетках CA5 и Jurkat. Это указывает на то, что проверенные LRA могут иметь внутренний эффект, приводящий к подавлению экспрессия гена PLK1 на уровне транскрипции и, следовательно, ухудшает выживаемость клеток резервуара, но индуцированная LRA реактивация ВИЧ-1 повышает уровень белка PLK1, который, вероятно, противодействует опосредованному LRA подавлению PLK1 и способствует выживанию ВИЧ-1-реактивированных клеток.

Лечение клеток J-Lat A2, полученных из латентных клеток ВИЧ-1, и клеток J-Lat 10.6 со вставленным GFP, не смогли вызвать повышение уровня белка PLK1. Это указывало на то, что некоторые определенные вирусные компоненты из генома ВИЧ-1, опосредуют такой эффект.

Специалистам также удалось подтвердить, что реактивация ВИЧ-1 вызывает повышение уровня белка PLK1 в первичной CD4 +  Т-клеточной модели, которая позволяет установить латентность ВИЧ-1 в неполяризованной in vitro центральной памяти CD4 + Т-клетки (ТКМ) с использованием псевдотипированного VSV-G вируса DHIV с делецией env. ВИЧ-1 реактивация была вызвана обработкой этих клеток ингенолом, TNF-альфа и CD3 / антителами к CD28 с последующим измерением на основе иммуноокрашивания экспрессии gag p24 PLK1 и ВИЧ-1. TNF-альфа не смог реактивировать латентный ВИЧ-1, вероятно, из-за крайне низкой экспрессии рецептора TNFR в клетках TCM, что не привело к увеличению PLK1. Однако использование антител к ингенолу и CD3 / CD28 вызывало повышение уровня белка PLK1, что коррелировало с их потенцией, обращающей латентность. Для сравнения: воздействие на CD4+ Т-клетки без провирусов ВИЧ-1 с антителами к ингенолу и CD3 / CD28 не влияли на PLK1 уровень белка.

Таким образом, полученные авторами результаты подтвердили идею того, что именно отсрочка реактивация ВИЧ-1 влияет на повышение уровня белка PLK1.